活性氧檢測(cè)試劑盒的使用說(shuō)明
活性氧包括超氧自由基、過氧化氫及其下游產(chǎn)物過氧化物和羥化物等，參與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。活性氧檢測(cè)試劑盒是一種利用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行活性氧檢測(cè)的試劑盒。DCFHDA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無(wú)熒光的DCFH生成有熒光的DCF。故而檢測(cè)DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。活性氧檢測(cè)試劑盒的使用如下：
（1）裝載探針：對(duì)于刺激時(shí)間較短(通常為2小時(shí)以內(nèi))的細(xì)胞，先裝載探針，后用活性氧陽(yáng)性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞。對(duì)于細(xì)胞刺激時(shí)間較長(zhǎng)(通常為6小時(shí)以上)的細(xì)胞，先用活性氧陽(yáng)性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，后裝載探針。
（2）原位裝載探針
（3）收集細(xì)胞后裝載探針：按照1:1000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μM。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為一百萬(wàn)至二千萬(wàn)1×106～2×107/mL，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。
（4）加藥刺激：直接用活性氧陽(yáng)性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，或把細(xì)胞等分成若干份后刺激細(xì)胞。
（5）檢測(cè)：對(duì)于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
