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乙酰輔酶A羧化酶試劑盒 微量法

樣本的前處理

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟

1、 分光光度計或酶標儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長 660nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 酶促反應(yīng)試劑的配制和預(yù)熱：在試劑二瓶中加入 2.5mL 試劑一，充分溶解混勻；在試劑三瓶中加入 2mL 蒸餾水，充分溶解混勻；將試劑一、二、三在 37℃(哺乳動物)或 25℃ (其它物種)預(yù)熱 10 分鐘。

3、定磷試劑的配制：按 H2O: 試劑四:試劑五:試劑六=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑 應(yīng)為淺黃色，若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。注意：配試劑用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

4、0.5μmol/mL 標準磷應(yīng)用液配制：將試劑七 20 倍稀釋，即取 0.5mL 試劑七加 9.5 蒸餾水，充分混勻。

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ACC 活性計算： 1、按組織蛋白濃度計算：定義：每小時每毫克組織蛋白產(chǎn)生 1μmol 無機磷的量為一個 ACC 活力單位。 ACC (μmol/h/mg prot)=(C 標準管×V 總)×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)÷ (V 樣×Cpr)÷T=10×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)÷Cpr 2、按樣本鮮重計算：定義：每小時每 g 組織產(chǎn)生 1μmol 無機磷的量為一個 ACC 活力單位。 ACC (μmol/h /g 鮮重)=(C 標準管×V 總)×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管）×V 總÷ (W× V 樣÷V 樣總)÷T=10×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)÷W 3、 按細菌或細胞密度計算：定義：每小時每 500 萬細菌或細胞產(chǎn)生 1μmol 無機磷的量為一個 ACC 活力單位。 ACC (U/104 cell)=(C 標準管×V 總)×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管）×V 總÷ (500× V 樣÷V 樣總)÷T=0.02×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管) C 標準管：標準管濃度，0.5μmol/mL；V 總：酶促反應(yīng)總體積，0.1mL；V 樣：加入樣本體積，0.01mL ；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，0.5 小時；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。

ACC 能夠催化乙酰輔酶 A、NaHCO3和 ATP 生成丙二酰輔酶 A、ATP 和無機磷，通過鉬酸銨定磷法測定無機磷的增加量來測定 ACC 活性。